范围

本方法规定了体外荧光素渗漏试验的要求和方法。

本方法适用于化妆品用水溶性化学原料安全性毒理学检测。

实验目的

预测和评价化妆品用水溶性化学原料对眼睛是否具有强刺激性或腐蚀性。

试验步骤

3.1.1  细胞建模

3.1.1.1 细胞复苏

3.1.1.2 接种细胞于含10%胎牛血清且不含酚红的DMEM-F12（1：1）混合培养液中，每天观察细胞生长状态，稳定传2代后准备建模。

3.1.1.3 用胰酶-EDTA（0.05% w/v胰酶，0.02% w/v EDTA）消化细胞，收集细胞于离心管中，800～1000 rmp/min离心5 min，重新悬浮细胞于培养液中，调整细胞浓度为4×105 个/mL。

3.1.1.4 取无菌24孔板每孔加入400 μL新鲜培养基，将嵌入型细胞培养皿transwell（嵌入型细胞培养皿厚度为80～150 μm，孔径约0.45μm）放入24孔板中，注意避免气泡。其中21个transwell内室中加入400μL 细胞悬液（终浓度约1.6×105个/transwell），剩余3个transwell中加入同体积的培养液。将24孔板放入37 ℃ 5%CO2培养箱中培养96 h后，检测前一天transwell内外换新鲜培养液。

染毒和清洗

以400 μL/孔预热至37 ℃的HBSS（无酚红）清洗transwell内室2遍。以200 μL/孔的受试物浓度梯度溶液进行染毒，染毒时间为1 min，每个浓度做3个复孔，染毒后以400 μL/孔预热至37 ℃的HBSS（无酚红）清洗transwell内室2遍。同时空白对照、阴性对照和阳性对照做相应的处理。染毒图示见图1。

注：M：仅有transwell，不加细胞

B：种了细胞的transwell，加阴性对照（不含酚红的HBSS）

P：种了细胞的transwell，加阳性对照（100 mg/mL Brij-35溶液）

T1-T5：种了细胞的transwell，加配制好的受试物浓度梯度工作液，T1代表最低浓度，T5代表最高浓度

3.1.3  荧光素渗漏率测定及计算

5.2.3.1 荧光素渗漏率测定：取新的24孔板，每孔中加入400 μL HBSS（无酚红）溶液，将上述清洗后的transwell对应放入新的24孔板中，transwell内室加入400 μL 0.01%荧光素钠溶液，注意避免荧光素钠溶液直接进入transwell室外的孔中，室温避光静置30 min，然后从24孔板中移除transwell，移除时需避免transwell内室中多余的荧光素钠溶液进入24孔板。在多功能酶标仪中测定荧光强度(激发波长485 nm，发射波长530 nm)。根据荧光强度计算荧光素渗漏率FL（%）。

其中：m：三个重复测量的平均荧光强度；

x：最大荧光素渗漏的平均荧光强度（M组）；

y：0%荧光素渗漏的平均荧光强度（B组）。

5.2.3.2  FL20计算：根据受试物各浓度FL的结果，计算FL20。

其中：B：荧光素渗漏率<20%；

C：荧光素渗漏率﹥20%；

MC：C对应的浓度(mg/mL)；

MB：B对应的浓度(mg/mL)。

3.1..4  结果判定

当受试物FL20（mg/mL）≤ 100 mg/mL时，判定受试物具有眼腐蚀性或强刺激性。

3.1.5  系统成立的条件

需同时满足以下条件，否则应重复试验：

（1）建模成功后，细胞与transwell具有一定的结合度：0%荧光素渗漏的平均荧光强度（B组）应小于等于最大荧光素渗漏平均荧光强度（M组）的6%；

（2）阳性对照组荧光素渗漏率应介于20%~40%之间。

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