范围
本方法规定了化妆品用化学原料光反应性活性氧(ROS)测定试验的基本要求和方法。
本方法适用于预测化妆品用化学原料的潜在光毒性。
实验目的
预测化妆品用化学原料是否具有潜在光毒性。
试剂和材料
除另有规定外,本方法所用试剂均为分析纯或以上规格,水为 GB/T6682规定的一级水。所有试剂应在配制后1个月内使用,并且在使用前应超声处理,以免物质析出、沉淀对试验造成影响。主要试剂配制方法如下:
3.1 磷酸二氢钠。
3.2 磷酸氢二钠。
3.3 N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺(RNO)。
3.4 咪唑。
3.5 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)。
3.6 pH 7.4的20 mmol/L磷酸钠缓冲液(NaPB)
3.7 0.2 mmol/L N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺(RNO,CAS:138-89-6)
3.8 0.2 mmol/L咪唑(CAS:288-32-4)
3.9 0.4 mmol/L 氯化硝基四氮唑蓝(NBT,CAS:298-83-9)
3.10 溶剂的选择
3.11 待测化学物质溶液的配制
3.12 阴性对照及阳性对照
仪器和设备
4.1 太阳光模拟器
4.2 反应容器
4.3 酶标仪。
4.4 UVA紫外照度计。
4.5 显微镜。
分析步骤
5.1 将下列成分在避光条件下混合:
5.1.1 溶剂为DMSO的受试物:
以20 μL溶剂替代受试物,作为空白对照。涡旋或超声5~10 min后,将200 μL反应混合物加入到96孔板中,每组设置3个平行。96孔板加样详见附录D。
5.2 在100倍显微镜下检查反应混合物中各组分溶解情况。如有沉淀、析出等现象,需降低受试物浓度重新检测或停止检测。将96孔板震荡5 s后,使用分光光度计或酶标仪测定光照前SO检测孔在440 nm下的吸光度及SA检测孔在560 nm下的吸光度。
5.3 将96孔板置于石英反应器中,或盖上其他具有高UV透射率的盖子或密封件,置于太阳光模拟器中照射1 h。记录光照前后的温度。
5.4 完成光照后,将96孔板震荡1 min,使用分光光度计或酶标仪测定光照后SO检测孔在440 nm下的吸光度及SA检测孔在560 nm下的吸光度。
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